Molekulární diagnostika plicních onemocnění

Úvod

V dnešní době zaznamenáváme zvyšující se zájem o vývoj neinvazivních prostředků diagnostiky plicních onemocnění založených na analýze látek vznikajících v plicích jako důsledek odehrávajících se patologických procesů. Doposud známé techniky (např. spirometrie nebo bronchoprovokační testy apod.) jsou považovány za invazivní - obnášejí zásah do lidského organismu. Neinvazivní alternativou získávání vzorků je odběr kondenzátu vydechovaného vzduchu (KVV), který pacienti včetně dětí a starších osob dobře snášejí. KVV představuje tělní tekutinu, jejíž složení koresponduje s ději bezprostředně se odehrávajícími v plicích a dýchacích cestách a představuje tak užitečný nástroj pro získávání informací k porozumění průběhu různých patologických dějů (oxidační stres, zánětlivé procesy) probíhajících v dýchací soustavě.

Základní (99%) složkou KVV je kondenzovaná vodní pára a látky rozpustné ve vodném prostředí, jen malá část kondenzátu pochází z kapiček obsahujících látky ve vodě nerozpustné. Tyto látky jsou ve formě aerosolu strhávány turbulentním prouděním v alveolách a hromadí se v kondenzačním zařízení (obr. 1).

 



Obr. 1: Vznik kondenzátu vydechovaného vzduchu. Na povrchu dýchacích cest a v alveolách dochází k vypařování těkavých látek, látky nerozpustné ve vodě tvoří binární systém na povrchu dýchacích cest, aerosolové částice jsou unášeny turbulentním prouděním (vlevo). Aerosolové částečky jsou sbírány v kondenzátoru vydechovaného vzduchu, kde také dochází ke kondenzaci vodní páry a dalších těkavých látek (vpravo).

 

Kondenzátor vydechovaného vzduchu (obr. 2) je komerčně vyráběné, jednoduché a přenosné zařízení použitelné při různých situacích.

 



Obr. 2: Kondenzátor vydechovaného vzduchu (vlevo) a klinický odběr vzorků KVV (vpravo).

 

V průběhu desetiminutového dýchání dospělých jedinců do přístroje je možno získat 1-3 ml KVV. Takový objem vzorku je dostačující na provedení základní kvalitativní a kvantitativní analýzy.

Základním cílem našeho projektu je vyvinout analytickou metodu pro kvalitativní a kvantitativní analýzu látek (tzv. biomarkerů) typických pro poškození fosfolipidů, nukleových kyselin a proteinů v důsledku oxidativního stresu a látek přítomných v plicích v důsledku probíhající zánětlivé a alergické reakce, tzn. vyvinout multimarkerový screening KVV podávající klinický obraz dýchací soustavy. Nedílnou součástí práce je testování spolehlivosti vyvinuté diagnostické metody a provedení klinické studie (ve spolupráci s 1. LF UK), jejímž cílem je porovnat koncentrační hladiny řady biomarkerů ve skupině pacientů s diagnostikovaným plicními onemocněními (diagnostika pomocí „klasických“ diagnostických testů – spirometrie, výsledky bronchoprovokačních testů apod.) a kontrolní skupinou zdravých subjektů.

Námi vyvíjená metoda je založená na kombinaci vhodné derivatizační a separační techniky a citlivé a selektivní detekční metody na bázi hmotnostní spektrometrie, která představuje spolehlivý a vysoce sensitivní kvalitativní a kvantitativní nástroj pro stanovení celé řady biomarkerů.

Řešené problematiky

1. Analýza biomarkerů oxidačního stresu (aldehydy, guanosiny, isoprostany, tyrosiny)

Plíce existují v prostředí bohatém na kyslík, mají velký povrch a širokou zásobu krve. Proto jsou náchylné k poškozením způsobeným reaktivními kyslíkovými částicemi (ROS). Se zvyšující se produkcí ROS jsou spojeny i oxidační přeměny proteinů, nukleových kyselin a fosfolipidů, které mohou zapříčinit přímé poškození plic, či indukovat paletu různých buněčných odpovědí prostřednictvím produkce reaktivních sekundárních metabolických látek. Podrobnější popis této problematiky je v článku Biomarkery oxidačního stresu.

2. Analýza biomarkerů enzymatické oxidace (leukotrieny)

Leukotrieny jsou látky uvolňované při zánětlivých procesech a alergických reakcích. Vznikají enzymatickou oxidací kyseliny arachidonové. Jako první vzniká leukotrien A4 (LTA4). Z něj při zánětlivých procesech vzniká ve zvýšené míře LTB4, v průběhu alergické reakce vzniká první z řady cysteinylovaných leukotrienů - LTC4. Ten je dále přeměňován na LTD4, ze kterého následně vzniká LTE4. Cysteinylované leukotrieny interagují s Cys-LT receptory, které se nacházejí především na buňkách hladkých svalů. Navázáním cysteinylovaných leukotrienů na Cys-LT1 receptory nacházející se v plicích a dýchacích cestách dochází ke konstrikci bronchů, k překrvení sliznic a ke zvýšené sekreci vazkého hlenu, čímž dochází k zúžení průsvitu dýchacích cest a k opakovaným epizodickým stavům výdechové dušnosti.

Vyšší koncentrační hladiny leukotrienů je možno stanovit např. u bronchiálního astmatu.

3. Multimarkerový screening

Vývoj metody pro multimarkerový screening KVV je vývoj jedné společné metody pro stanovení co největšího počtu látek v KVV. Tato metoda umožní získat maximum informací i z minimálního množství vzorku.